Suge-pozoiak karboxilo ester loturak hidrolizatzen dituzten entzimak ditu.Hidrolisirako substratuak fosfolipidoak, azetilkolina eta azetato aromatikoa dira.Entzima hauek hiru mota daude: fosfolipasa, azetilkolinesterasa eta esterasa aromatikoa.Suge-pozoietan arginina esterasak arginina edo lisina sintetikoa ere hidroliza dezake, baina naturan proteina peptidoen loturak hidrolizatzen ditu batez ere, beraz, proteasari dagokio.Hemen eztabaidatutako entzimek ester-substratuetan soilik jarduten dute eta ezin dute inolako lotura peptidikoetan eragin.Entzima horien artean, azetilkolinesterasaren eta fosfolipasaren funtzio biologikoak garrantzitsuagoak dira eta guztiz aztertu dira.Suge-pozoi batzuek esterasa aromatikoen jarduera handia dute, eta horrek p-nitrofenil etil esterra, a - edo P-naftaleno azetatoa eta indol etil esterra hidroliza ditzake.Oraindik ez da jakiten jarduera hori entzima independente batek edo karboxilesterasaren bigarren mailako efektu ezagun batek sortzen duen, are gutxiago bere esangura biologikoa.Agkistrodon halys Japonicus-en pozoia p-nitrofenil etil ester eta indol etil esterrekin erreakzionatu zenean, ez ziren p-nitrofenolaren eta indol fenolaren hidrolizatuak aurkitu;Aitzitik, ester hauek kobra Zhoushan azpiespezie suge-pozoiarekin eta Bungarus multicinctus suge-pozoiarekin erreakzionatzen badute, azkar hidrolizatuko dira.Jakina da kobra-pozoi hauek kolinesterasa aktibitate handia dutela, eta horrek goiko substratuen hidrolisiaren erantzule izan dezake.Izan ere, Mclean et al.(1971) Cobra familiako suge pozoi askok indol etil ester, naftaleno etil ester eta butil naftaleno ester hidroliza ditzaketela jakinarazi zuten.Suge-pozoi hauek datoz: kobra, lepo beltzaren kobra, ezpain beltzaren kobra, urrezko kobra, Egiptoko kobra, errege-kobra, urrezko kobra mamba, mamba beltza eta ezpain zuriko mamba (D. aw-k oraindik ezagutzen du ekialdeko erronbola-kantaletaren sugea).
Suge-pozoiak metil indol etil-esterra hidroliza dezake, hau da, serumeko kolinesterasaren jarduera zehazteko substratua, baina suge-pozoi honek ez du kolinesterasa jarduera erakusten.Honek erakusten du kobra-pozoian esterase ezezagun bat dagoela, kolinesterasaren ezberdina dena.Entzima honen izaera ulertzeko, bereizketa lan gehiago behar da.
1, Fosfolipasa A2
(I) Ikuspegi orokorra
Fosfolipasa glizeril fosfatoa hidroliza dezakeen entzima da.Naturan 5 fosfolipasa mota daude, hau da, fosfolipasa A2 eta fosfolipasa.
A. , fosfolipasa B, fosfolipasa C eta fosfolipasa D. Suge-pozoiak batez ere A2 fosfolipasa (PLA2) dauka, suge-pozoi batzuek B fosfolipasa dute eta beste fosfolipasa batzuk animalien ehunetan eta bakterioetan aurkitzen dira batez ere.3-11-4 irudiak fosfolipasa hauen akzio-gunea erakusten du substratuaren hidrolisian.
Fosfolipasen artean, PLA2 gehiago aztertu da.Suge-pozoian gehien aztertutako entzima izan daiteke.Bere substratua Sn-3-glicerofosfatoaren bigarren posizioan dagoen ester lotura da.Entzima hau suge-pozoietan, erle-pozoietan, eskorpioi-pozoietan eta animalia-ehunetan dago, eta PLA2 ugaria da lau familiako suge-pozoietan.Entzima honek globulu gorriak hautsi eta hemolisia eragiten duenez, "hemolisina" ere esaten zaio.Batzuek PLA2 lezitinasa hemolitikoa ere deitzen diote.
Ludeekek aurkitu zuen lehenik suge-pozoiak konposatu hemolitiko bat sor dezakeela entzimen bidez lezitinari eraginez.Geroago, Delezenne et al.frogatu zuen kobra-pozoiak zaldi-serum edo gorringoan eragiten duenean substantzia hemolitiko bat sortzen duela.Gaur egun jakina da PLA2-ak eritrozitoen mintzaren fosfolipidoetan zuzenean eragin dezakeela, eritrozitoen mintzaren egitura suntsituz eta hemolisi zuzena eraginez;Serumean edo gehitutako lezitinan ere eragin dezake lezitina hemolitikoa ekoizteko, zeinak globulu gorrietan eragiten baitu zeharkako hemolisia sortzeko.PLA2 suge-pozoinen lau familietan ugaria den arren, hainbat suge-pozoitan entzimen edukia zertxobait desberdina da.Sugea (C
Suge-pozoiak PLA2 jarduera ahula baino ez zuen erakutsi.3-11-11 taulak Txinako suge pozoitsuen 10 pozoi nagusien PLA2 jardueraren alderaketa erakusten du.
3-11-11 taula Txinan 10 suge-pozoiren fosfolipasa VIII jardueren konparaketa
Suge pozoia
Gantz askatzea
Azido alifatikoa,
Cjumol/mg)
Jarduera hemolitikoa CHU50/^ g * ml)
Suge pozoia
Gantz-azidoak askatu
(^raol/mg)
Jarduera hemolitikoa "(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
hamaika
Micracephal ofis
bost puntu bat zero
kalyspallas
8. 68
bi mila eta zortziehun
gracilis
V, acutus
7. 56
** #
Ophiophagus hannah
hiru puntu zortzi bi
ehun eta berrogei
Bnugarus fastatus
7,56
berrehun eta laurogei
B. multicinctus
bat puntu bederatzi sei
berrehun eta laurogei
Sugegorria
zazpi puntu zero hiru
T, mucrosquamatos
bat puntu zortzi bost
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Bereizketa eta arazketa
PLA2-aren edukia suge-pozoian handia da, eta egonkorra da beroa, azidoa, alkalia eta desnaturalizatzailea, beraz, erraza da PLA2 arazteko eta bereizteko.Metodo arrunta lehenengo gel-iragazkia pozoi gordinean egitea da, gero ioi-trukearen kromatografia egitea eta hurrengo urratsa errepikatu daiteke.Kontuan izan behar da ioi-trukearen kromatografiaren ondoren PLA2 liozitatzeak ez duela agregaziorik eragin behar, liofilizazio-prozesuak sarritan sistemaren indar ionikoa handitzen duelako, hau da, PLA2-ren agregazioa eragiten duen faktore garrantzitsua.Aurreko metodo orokorrez gain, metodo hauek ere onartu dira: ① Wells et al.② PLA2-ren substratu analogoa afinitate-kromatografiarako ligando gisa erabili zen.Ligando hau PLA2-ra lotu daiteke suge-pozoian Ca2+-arekin.EDTA eluitzaile gisa erabiltzen da gehienbat.Ca2+ kendu ondoren, PLA2 eta ligandoaren arteko afinitatea gutxitzen da, eta ligandotik disoziatu daiteke.Beste batzuek %30eko disoluzio organikoa edo 6mol/L urea erabiltzen dute eluitzaile gisa.③ Kromatografia hidrofobikoa PheiiylSephar0SeCL-4Brekin egin zen kardiotoxinako PLA2 arrastoa kentzeko.④ PLA2 antigorputza ligando gisa erabili zen PLA2-n afinitate-kromatografia egiteko.
Orain arte, suge pozoi PLAZ kopuru handi bat araztu da.Tu et al.(1977) suge-pozoitik araztutako PLA2 zerrendatu zuten 1975. urtea baino lehen. Azken urteotan, PLA2-aren bereizketa eta arazketari buruzko artikulu ugari jakinarazi dira urtero.Hemen, Txinako jakintsuek PLAren bereizketa eta arazketan zentratzen gara.
Chen Yuancong et al.(1981) hiru PLA2 espezie bereizi zituzten Zhejiang-ko Agkistrodon halys Pallas-en pozoitik, PLA2 azido, neutro eta alkalinoetan bana daitezkeen puntu isoelektrikoen arabera.Bere toxikotasunaren arabera, PLA2 neutroa toxikoagoa da, Agkistrodotoxina neurotoxina presinaptiko gisa identifikatu dena.PLA2 alkalinoa ez da hain toxikoa, eta PLA2 azidoak ez du ia toxikotasunik.Wu Xiangfu et al.(1984) hiru PLA2ren ezaugarriak alderatu zituzten, besteak beste, pisu molekularra, aminoazidoen konposizioa, N-terminala, puntu isoelektrikoa, egonkortasun termikoa, entzimaren jarduera, toxikotasuna eta jarduera hemolitikoa.Emaitzek erakutsi zuten antzeko pisu molekularra eta egonkortasun termikoa zutela, baina alde nabarmenak zituzten beste alderdi batzuetan.Entzimaren jardueraren alderdian, entzimaren jarduera azidoen jarduera entzima alkalinoen jarduera baino handiagoa zen;Arratoiaren globulu gorrietan entzima alkalinoaren efektu hemolitikoa izan zen indartsuena, entzima neutroaren ondoren, eta entzima azidoa ia ez zen hemolizatzen.Hori dela eta, PLAZ-en efektu hemolitikoa PLA2 molekularen kargarekin lotuta dagoela uste da.Zhang Jingkang et al.(1981) Agkistrodotoxina kristalak egin dituzte.Tu Guangliang et al.(1983) jakinarazi zuten 7.6 puntu isoelektrikoa duen PLA toxiko bat isolatu eta araztu zela Fujian-eko Vipera rotundus-en pozoitik, eta bere propietate fisiko eta kimikoetatik, aminoazidoen konposizioarekin eta N-ko 22 aminoazido-hondakinen sekuentziatik. -terminal zehaztu ziren.Li Yuesheng et al.(1985) Fujian-eko Viper rotundus-en pozoitik beste PLA2 bat isolatu eta araztu zuten.PLA2 *-ren azpiunitatea 13 800 da, puntu isoelektrikoa 10,4 eta jarduera espezifikoa 35/xnioI/miri mg。 Lezitina substratua izanik, entzimaren pH optimoa 8,0 da eta tenperatura optimoa 65 °C. LD5 saguetan zain barnean injektatzen da.0,5 ± 0,12 mg/kg da.Entzima honek efektu antikoagulatzaile eta hemolitiko nabariak ditu.PLA2 molekula toxikoa 18 aminoazido motaren 123 hondakinez osatuta dago.Molekula aberatsa da zisteina (14), azido aspartiko (14) eta glizina (12), baina metionina bakarra dauka, eta bere N-terminala serina-hondarra da.Tuguang-ek isolatutako PLA2rekin alderatuta, bi isoentzimen pisu molekularra eta aminoazidoen hondakinen kopurua oso antzekoak dira, eta aminoazidoen konposizioa ere oso antzekoa da, baina azido aspartikoen eta prolinaren hondakinen kopurua zertxobait desberdina da.Guangxi errege kobra suge-pozoiak PLA2 aberatsa dauka.Shu Yuyan et al.(1989) pozoitik PLA2 bat isolatu zuten, jatorrizko pozoia baino 3,6 aldiz handiagoa den jarduera espezifikoa, 13000ko pisu molekularra, 122 aminoazido-hondarren konposizioa, 8,9ko puntu isoelektrikoa eta egonkortasun termiko ona.Oinarrizko PLA2-k globulu gorrietan duen eraginari buruzko mikroskopio elektronikoaren behaketatik, ikus daiteke giza globulu gorrien mintzean eragin nabaria duela, baina ez duela ahuntzaren globulu gorrietan eragin nabarmenik.PLA2 honek atzerapen eragin nabaria du globulu gorrien abiadura elektroforetikoan gizaki, ahuntz, untxi eta kobaia.Chen et al.Entzima honek ADP, kolageno eta sodio azido arakidonikoak eragindako plaketen agregazioa inhibitu dezake.PLA2 kontzentrazioa 10/xg/ml~lOOjug/ml denean, plaketen agregazioa erabat inhibitzen da.Garbitutako plaketak material gisa erabiliko balira, PLA2-k ezin zuen agregazioa eragotzi 20Mg/ml-ko kontzentrazioan.Aspirina ziklooxigenasaren inhibitzailea da, PLA2-ren eragina plaketetan inhibitu dezakeena.PLA2-k plaken agregazioa eragotzi dezake azido arakidonikoa hidrolizatuz A2 tronboxanoa sintetizatzeko.Zhejiang probintzian Agkistrodon halys Pallas pozoiak ekoitzitako PLA2-ren konformazioa dikroismo zirkularraren, fluoreszentzia eta UV xurgapenaren bidez aztertu zen.Emaitza esperimentalek erakutsi zuten entzima honen kate-konformazio nagusia beste espezie eta genero batzuen entzima-mota berekoaren antzekoa zela, eskeleto-konformazioak bero-erresistentzia ona zuela eta ingurune azidoaren egitura-aldaketa itzulgarria zela.Ca2+aktibatzailea eta entzimaren konbinazioak ez du triptofano-hondakinen ingurunean eragiten, Zn2+ inhibitzaileak, berriz, alderantziz.Disoluzioaren pH balioak entzimaren jarduerari eragiten dion modua goiko erreaktiboen aldean desberdina da.
Suge-pozoiaren PLA2 arazteko prozesuan, ageriko fenomeno bat da suge-pozoiak bi PLA2 eluzio-puntu edo gehiago dituela.Fenomeno hau honela azal daiteke: ① isozimak egoteagatik;② PLA2 mota bat hainbat pisu molekularreko PLA2 nahasketatan polimerizatzen da, gehienak 9 000 ~ 40 000 bitartekoak;③ PLA2 eta suge pozoiaren beste osagai batzuen konbinazioak PLA2 zaildu egiten du;④ PLA2-ko amida lotura hidrolizatzen denez, karga aldatzen da.① Eta ② ohikoak dira, salbuespenak salbuespen, PLA2 adibidez CrWa/w suge-pozoia
Bi egoera daude: ① eta ②.Hirugarren baldintza PLA2-n aurkitu da suge hauen pozoian: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, Palestinako sugegorria, hondar sugegorria eta izugarrizko suge-kantalu km。
④ kasuaren emaitzak elektroforesian PLA2-ren migrazio-abiadura aldatzen du, baina aminoazidoen konposizioa ez da aldatzen.Peptidoak hidrolisiaren bidez hautsi daitezke, baina, oro har, lotu disulfuroen bidez lotzen dira oraindik.Ekialdeko hobi-sugearen pozoiak bi PLA2 forma ditu, a eta p motako PLA2 izenekoak hurrenez hurren.Bi PLA2 mota hauen arteko aldea aminoazido bakarra da, hau da, PLA2 molekula batean glutamina beste PLA2 molekula batean azido glutamikoarekin ordezkatzen da.Desberdintasun horren arrazoi zehatza argi ez dagoen arren, orokorrean PLA2-ren desaminazioarekin lotuta dagoela uste da.Palestinako sugegorrien pozoiaren PLA2 pozoi gordinarekin bero mantentzen bada, bere entzimetako molekulen amaierako taldeak lehen baino gehiago bihurtuko dira.Suge-pozoitik isolatutako C PLA2-k bi N-terminal desberdin ditu, eta bere pisu molekularra 30000 da. Fenomeno hau PLA2-ren dimero asimetrikoak eragin dezake, hau da, PLA2-k ekialdeko diamante bizkarreko sugearen pozoian sortutako dimero simetrikoaren antzekoa. eta mendebaldeko diamante bizkarreko sugea.Asiako kobra azpiespezie ugariz osatuta dago, eta horietako batzuk ez dira oso zehatzak sailkapenean.Adibidez, Cobra Outer Caspian azpiespezie deitzen zena gaur egun ezagutzen da
Kanpoko Kaspiar Itsas Kobrari egotzi behar zaio.Azpiespezie asko daudenez eta elkarrekin nahasten direnez, suge-pozoiaren konposizioa asko aldatzen da iturri ezberdinengatik, eta PLA2 isozimen edukia ere handia da.Adibidez, kobra pozoia
Gutxienez r ^ ll espezieko 9 PLA2 isozima mota aurkitu ziren, eta 7 PLA2 isozima mota aurkitu ziren Caspian kobra azpiespeziearen pozoian.Durkin et al.(1981) suge-pozoi ezberdinetan PLA2 edukia eta isozima-kopurua aztertu zituzten, 18 kobra-pozoin, 3 mamba-pozoin, 5 suge-pozoin, 16 txintxo-pozoin eta 3 itsas-pozoin.Oro har, kobra-pozoiaren PLA2 jarduera handia da, isozima askorekin.PLA2 jarduera eta sugegorrien pozoiaren isozimak ertainak dira.Mamba-pozoiaren eta txintxo-pozoiaren PLA2 jarduera oso baxua da edo PLA2-ren jarduera ez da.Itsasoko suge-pozoiaren PLA2 jarduera ere baxua da.
Azken urteotan, ez da jakinarazi suge-pozoietan PLA2 dimero aktibo moduan dagoenik, hala nola, ekialdeko rhombophora sugeak (C. suge-pozoiak a eta P motako PLA2 ditu, bi azpiunitate berdinez osatuta daude biak). , eta dimerasak bakarrik dauka
Jarduera.Shen et al.ere proposatu zuen suge-pozoiaren PLA2-ren dimeroa soilik dela entzimaren forma aktiboa.Egitura espazialaren azterketak ere frogatzen du mendebaldeko diamante bizkarreko sugearen PLA2 dimero moduan existitzen dela.Konposatu piziboroa
Suge-pozoiaren bi PLA ^ Ei eta E2 daude, zeinetan 仏 dimero moduan dagoen, dimeroa aktiboa da eta bere monomero disoziatua inaktiboa da.Lu Yinghua et al.(1980) E. Jayanthi et al-en propietate fisiko eta kimikoak eta erreakzio zinetika gehiago aztertu zituzten.(1989) oinarrizko PLA2 bat (VRVPL-V) isolatu zuten sugegorriaren pozoitik.PLA2 monomeroaren pisu molekularra 10000 da, eta horrek eragin hilgarriak, antikoagulatzaileak eta edema ditu.Entzimak pisu molekular ezberdineko polimeroak polimeriza ditzake PH 4.8 baldintzapean, eta polimeroen polimerizazio-maila eta pisu molekularra areagotzen dira tenperatura igotzean.96 °C-tan sortutako polimeroaren pisu molekularra 53 100 da, eta polimero honen PLA2 jarduera bi handitzen da.
Argitalpenaren ordua: 2022-12-18